Laten we het vandaag hebben over het probleem dat talloze onderzoekscollega's heeft veroorzaakt - Western Blot (WB) -experiment. Dit schijnbaar eenvoudige maar vol met "Traps" -experiment, waarom doet het ons altijd steeds opnieuw struikelen? Laten we nu samen de redenen voor mislukkingen bekijken.
I. Geen bands
Mogelijke redenen kunnen zijn:
- Antilichaamproblemen: het antilichaam kan niet effectief, niet -specifiek of niet bindend zijn aan het doeleiwit.
- Monsterproblemen: het monster kan interfererende stoffen bevatten, te laag concentratie zijn of al zijn afgebroken.
- Elektroforese problemen: ongepaste elektroforese -omstandigheden, zoals spanning, tijd of onjuist gebruik van buffer.
- Overdrachtsproblemen: problemen tijdens het overdrachtsproces, zoals ongepaste membraanselectie, overdrachtstijd of overdrachtsbuffer.
- Blokkeringsproblemen: de blokkeeroplossing kan ongepast zijn of de blokkeertijd kan te lang zijn.
- Vlekkende problemen: het kleurreagens kan worden verlopen, ongevoelig of onjuist worden gebruikt.
Problemen met apparatuur: de apparatuur kan niet goed werken of niet correct worden gekalibreerd.
- Experimentele werkproblemen: de experimentele operatie kan niet worden gestandaardiseerd, zoals onvoldoende wassen of ongelijke monsterbelasting.
- Problemen met eiwitmodificatie: het doel-eiwit kan post-translationele modificaties ondergaan die antilichaamherkenning voorkomen.
- Problemen met doel -eiwitexpressie: het doeleiwit kan een zeer lage expressie hebben of geen expressie in de cellen of weefsels die worden gedetecteerd.
II. Hoge achtergrond
Mogelijke redenen kunnen zijn:
- Hoge antilichaamconcentratie: het gebruik van te veel antilichaam kan niet -specifieke binding verhogen, wat resulteert in een hoge achtergrond.
- Kwaliteitsproblemen voor antilichamen: het antilichaam kan een hoge niet-specifieke binding hebben of kruisreageren met andere eiwitten.
- Onvoldoende blokkering: de blokkeeroplossing dekt niet effectief niet -specifieke bindingsplaatsen op het membraan, wat resulteert in een hoge achtergrond.
- Membraanproblemen: het membraan kan een slechte kwaliteit of verontreiniging hebben, wat leidt tot een hoge achtergrond.
- Onvolledige overdracht: tijdens het overdrachtsproces mogen eiwitten niet volledig worden overgedragen op het membraan, wat resulteert in een hoge achtergrond.
- Onvoldoende wassen: de wasstappen kunnen niet effectief ongebonden antilichaam of andere onzuiverheden verwijderen, wat leidt tot een hoge achtergrond.
- Vlekkende reagensproblemen: het kleurreagens kan te gevoelig of onstabiel zijn, wat resulteert in een hoge achtergrond.
- Problemen met experimentele apparatuur: de apparatuur kan lekkage of interferentie hebben, wat leidt tot een hoge achtergrond.
- Eiwitmonsterproblemen: het monster kan een grote hoeveelheid interfererende stoffen bevatten, zoals eiwitafbraakproducten of andere onzuiverheden.
- Experimentele werkproblemen: de experimentele operatie kan niet worden gestandaardiseerd, zoals langdurige incubatietijd of hoge temperatuur.
Iii. Niet -specifieke banden of onjuiste eiwitbandgroottes
Mogelijke redenen kunnen zijn:
- Te veel passages van cellen, resulterend in verschillende eiwitexpressieniveaus, wat leidt tot inconsistente bandgroottes of de aanwezigheid van meerdere banden.
- Degradatie van eiwitmonster, resulterend in een lager eiwitmolecuulgewicht of de aanwezigheid van meerdere banden.
- In vivo tot expressie gebrachte eiwitmonsters kunnen verschillende vormen van modificaties hebben zoals acetylering, methylatie, alkylering, fosforylering en glycosylatie, wat leidt tot inconsistente bandgroottes of de aanwezigheid van meerdere banden.
- Het doel -eiwit bevat meerdere isovormen of splitsingsvarianten, wat resulteert in inconsistente bandgroottes of de aanwezigheid van meerdere banden.
